水產(chǎn)動物病原菌藥敏試驗

十二少

臨床微生物實驗室進行藥敏試驗的方法主要有紙片擴散法，稀釋法（包括瓊脂和肉湯稀釋法），抗生素濃度梯度法（E-test法），和自動化儀器等。水產(chǎn)微生物最常用到的是紙片擴散法。

紙片擴散法：

該法是將含有定量抗菌藥物的濾紙片貼在已接種了測試菌的瓊脂表面上，紙片中的藥物在瓊脂中擴散，隨著擴散距離的增加，抗菌藥物的濃度呈對數(shù)減少，從而在紙片的周圍形成濃度梯度。

同時，紙片周圍抑菌濃度范圍內(nèi)的菌株不能生長，而抑菌范圍外的菌株則可以生長，從而在紙片的周圍形成透明的抑菌圈，不同的抑菌藥物的抑菌圈直徑因受藥物在瓊脂中擴散速度的影響而可能不同，抑菌圈的大小可以反映測試菌對藥物的敏感程度，并與該藥物對測試菌的MIC（最小抑制濃度）呈負相關。



一、實驗材料
1、培養(yǎng)基：
目前水產(chǎn)常用的有以下幾種



2、藥敏試紙：購買或自制（詳見實驗準備）

3、細菌：待做藥敏試驗的細菌（包括水產(chǎn)動物病變組織、體液或已分離培養(yǎng)的菌種等）

4、儀器：解剖剪、鑷子、接種環(huán)、酒精燈、移液器、滴頭。

二、實驗準備

1、藥液的制備：按商品藥的使用治療量的比例配制藥液，如取“氟多力”80～100微克加入1ml的水中混勻，可按這個比例配制藥液。此稀釋液即為用于做藥敏試驗的藥液。

2、藥敏片的準備

1）取定性濾紙，用打孔機打成6毫米直徑的圓形小紙片。取圓紙片50片放入清潔干燥的空瓶中，瓶口以單層牛皮紙包扎。經(jīng)15磅15～20分鐘高壓消毒后，放在37℃溫箱或烘箱中數(shù)天，使完全干燥。

2）在上述含有50片紙片的瓶內(nèi)加入藥液0.25毫升，并翻動紙片，使各紙片充分浸透藥液，翻動紙片時不能將紙片搗爛。同時在瓶口上記錄藥物名稱，放37℃溫箱內(nèi)過夜，干燥后即密蓋，如有條件可真空干燥。切勿受潮，置陰暗干燥處存放，有效期3～6個月。

三、實驗操作方法

1、細菌涂布

1）取病變組織或體液（肝、脾、腎，腸膿液等），輕輕在平板上均勻涂一層。

具體方式：用滅菌解剖剪和鑷子，剪取動物病變組織；或用滅菌棉拭子蘸取病變部位體液，在平板上輕輕涂布均勻。此方法適合臨床快速確定選擇用藥。

2）若已做細菌分離培養(yǎng)，可直接用經(jīng)酒精燈火焰滅菌的接種環(huán)挑取適量細菌培養(yǎng)物，以劃線方式將細菌涂布到平皿培養(yǎng)基上。具體方式：用滅菌接種環(huán)取適量細菌分別在平皿邊緣相對四點涂菌，以每點開始劃線涂菌至平皿的1/2。然后，找到第二點劃線至平皿的1/2，依次劃線，直至細菌均勻密布于平皿。（另：可挑取待試細菌于少量生理鹽水中制成細菌混懸液，用滅菌棉拭子將待檢細菌混懸液涂布于平皿培養(yǎng)基表面。要求涂布均勻致密，直接懸液法要把菌液濃度用生理鹽水或PBS調(diào)到0.5個麥氏標準再涂布均勻。）

2、貼藥敏片

將鑷子于酒精燈火焰滅菌后略停，取藥敏片貼到平皿培養(yǎng)基表面。為了使藥敏片與培養(yǎng)基緊密相貼，可用鑷子輕按幾下藥敏片。為了使能準確的觀察結(jié)果，要求藥敏片能有規(guī)律的分布于平皿培養(yǎng)基上；一般可在平皿中央貼一片，外周可等距離貼若干片（外周一般可貼七片），每種藥敏片的名稱要在培養(yǎng)皿上標注。

3、培養(yǎng)
將平皿培養(yǎng)基置于37℃溫箱中培養(yǎng)24小時后，觀察效果。

四、結(jié)果觀察

在涂有細菌的瓊脂平板上，抗菌藥物在瓊脂內(nèi)向四周擴散，其濃度呈梯度遞減，因此在紙片周圍一定距離內(nèi)的細菌生長受到抑制。過夜培養(yǎng)后形成一個抑菌圈，抑菌圈越大，說明該菌對此藥敏感性越大，反之越小，若無抑菌圈，則說明該菌對此藥具有耐藥性。其直徑大小與藥物濃度、劃線細菌濃度有直接關系。

五、判定標準

藥敏實驗的結(jié)果，應按抑菌圈直徑大小作為判定敏感度高低的標準。



具體對于不同的菌株，及不同的抗生素紙片需參照NCCLs的標準或者CLSI標準。

六、應用

藥物敏感實驗后，應選擇高敏藥物進行治療，也可選用兩種藥物協(xié)助使用，以減少耐藥菌株。在選擇高敏藥物時應考慮藥物的吸收途徑，因為我們藥敏實驗是藥液直接和細菌接觸，而在給水產(chǎn)動物用藥的時候，必須通過機體的吸收才能使藥物達到一定的效果，所以在治療水產(chǎn)動物疾病時，高敏藥物一定要配合適宜的給藥方法，這樣才會達到好的治療效果。


來源：利洋服務

十二少

leikunnuy：
牛啊！一個培養(yǎng)皿上能放12種藥敏片。

十二少

lwr2012：
這個是大的培養(yǎng)皿，估計是90的，研究所一般用的都是60的吧？

十二少

沙湖雙黃蛋回復leikunnuy：
“牛啊！一個培養(yǎng)皿上能放12種藥敏片。"

恩，現(xiàn)在公司發(fā)給我們的這東西，長期藥敏片用完了，培養(yǎng)基還用不到一半

十二少

leikunnuy回復lwr2012：
”這個是大的培養(yǎng)皿，估計是90的，研究所一般用的都是60的吧？“

我們做藥敏試驗也是用的90cm的玻璃培養(yǎng)皿的。

十二少

leikunnuy：
藥敏實驗的結(jié)果的判斷，還應該考慮藥敏片抗生素的濃度的。有些藥敏片抗生素的濃度是不一樣的。

十二少

水中寶：
微生物試驗中病原菌的人工培養(yǎng)溫度一般為35-37℃，培養(yǎng)時間多數(shù)為18-24h，但有時也要根據(jù)菌種及培養(yǎng)目的做最佳選擇。比如鏈球菌、愛德華氏菌最適生長溫度為37℃，弧菌一般30℃下培養(yǎng)，氣單胞菌屬一般在28℃培養(yǎng)，假單胞菌15-20℃生長最好。至于哪一種菌在此溫度下能不能培養(yǎng)出來，最終還是要看實驗結(jié)果。

上述數(shù)據(jù)只是查閱相關資料總結(jié)出來供大家學習參考，有些不完善的地方歡迎糾錯補漏。

較真的水貨

利洋的店都有藥敏做嗎？

leikunnuy

較真的水貨 發(fā)表于 2013-7-26 09:20
利洋的店都有藥敏做嗎？

都有的，基本上都有做。

Dannyhuang

能貼那么多紙片嗎？

白云飛雪

知道了敏感藥物，用藥劑量怎么得出？

lonelyfish

藥敏試驗結(jié)果只能作為臨床處方的參考，如果試驗結(jié)果為耐藥，那么臨床就不要使用，如果是敏感，可以在詢問用藥史的前提下選擇使用。關于菌株的培養(yǎng)溫度，最好是選擇菌株來源地的水溫，或者28℃。至于藥敏試驗結(jié)果的判定參照標準，參照CLSI是沒有錯的，但是CLSI推薦使用的培養(yǎng)基大多為MH培養(yǎng)基，只有在此培養(yǎng)基和其建設采用的溫度下才能參照CLSI的抑菌圈解釋標準。

白慕水

專業(yè)圍觀學習

牧心

我以前做了兩年的魚病藥敏實驗，我們是先從肝臟、腹水、血液中用接種環(huán)劃線，然后把細菌洗下來，然后再均勻涂布后貼紙片。今天拿來，后天出結(jié)果。有時候客戶比較急，且魚有大量腹水時，就直接涂布，也會有細菌長。最難以保證的的兩個問題是：長出來的有多少比例是病原菌；藥敏紙片的濃度該多少。有人說肝臟、腹水里面本來都是無菌的，如果有細菌長的話，應該是病原菌的比例比較大。藥敏紙片的濃度我們都是超過最低抑菌濃度，做定性。不過有些藥確實挺厲害，對每種細菌抑制效果都不錯。藥敏對臨床僅做參考，如果完全按照藥敏結(jié)果配藥，可能只有50%的把握。