由安迪蘇全球水產研究中心與巴塞羅那大學生物學院共同主導的一項研究結果，于2023年4月發表于《animals》期刊，該研究開創了關于溶血磷脂對魚類生理作用深入模式分析的首例。深入了解溶血磷脂對魚類腸道和肝臟營養代謝作用模式的影響，對指導溶血磷脂在水產動物飼料中的應用具有重要意義。因此安迪蘇中國水產團隊特將該文章關鍵信息提煉整理，以方便國內同行快速閱讀理解。

　　該實驗在挪威Sunndalsøra Nofima研究站進行。以大西洋鮭(Salmo salar)為養殖動物模型。采用平均重量為160g的魚苗，分為2個處理組，各4個水箱，每個水箱35條魚。分別飼喂對照飼料(C組)和添加了基于LPL的消化增強劑(0.1%乳速來®，安迪蘇提供)的飼料(LPL組)，進行12周的養殖實驗。養殖結束后進行生長參數和血漿脂質分析，以及小腸和肝臟蛋白質組學定量。

　　LPL顯著促進了大西洋鮭的生長表現

　　LPL飼料組魚的終末體重比對照組顯著增加了5%(p＜0.05)。LPL對魚的體長沒有影響，因此魚體肥滿度也提高了。LPL飼料組肝臟大小增加了10%以上(p＜0.05)。總采食量和飼料轉化率兩組均無顯著差異。見表1。

　　表1，對照組和LPL組飼料大西洋鮭的生物學參數

　　數據為平均值±SEM(n=105).

　　采用鳥槍法分析了大西洋鮭小腸和肝臟蛋白質組學定量，與大西洋鮭數據庫進行比對。圖1顯示了差異表達的蛋白質(DEPs)和生成的火山圖。

　　(A)腸道和肝臟DEPs餅狀圖。綠色(上調)和紅色(下調)扇形圖數據表示DEPs數據的FC(fold-change)倍數變化幅度區間。(B)腸道和肝臟DEPs的火山圖。火山圖y軸為p值的負對數。

　　腸道中確定了4984種蛋白質，187種DEPs，61種上調，126種下調。

　　肝臟中確定了4850種蛋白質，194種EPs,114種上調，80下調。

　　LPL顯示出對腸道細胞組分和代謝的調節作用

　　LPL對腸道上皮細胞的顯著影響體現在GO通路“細胞組分”的影響，包括70種DEPs。57種DEPs涉及運輸通路，顯著影響物質進入、離開或細胞內定向移動。45種DEPs涉及代謝通路，尤其是對脂質代謝(17個DEPs)的調節作用。蛋白磷酸化和乙酰化作用與翻譯后蛋白質修飾相關，蛋白質相互作用（PPI）的功能富集分別包含94和61種DEPs，表明LPLs可能參與這些通路。如圖2所示。

　　圖2 LPL組鮭魚的腸道蛋白質組相互作用功能富集圖

　　每個節點代表從腸道黏液樣品中通過鳥槍法蛋白質組學中獲得的一種差異表達蛋白(DEP)。頂部為功能網絡統計的詳細信息。選定的相關生物過程(底部)在每個節點用相應的顏色表示。按照偽發現率(FDR)值，主要Reactome通路和翻譯后修飾顯著聚類總結如下表

　　LPL改善了囊泡運輸、黏液形成和細胞代謝等特定通路

　　飼料LPLs引起的細胞重組中，腸道上調的DEPs構建的交互作用與“細胞內細胞器”高度相關，57種上調的DEPs中50種顯著富集在該通路(圖3A)。對這50種與腸細胞器功能相關的蛋白質進行的更深入分析表明，LPLs改善了“囊泡運輸”、“黏液形成”和“細胞代謝”的特定通路(圖4)。

　　12種DEPs差異聚類到“囊泡運輸”相關過程(圖4A)，如“內泌體和外泌體囊泡”、“高爾基體囊泡”和“囊泡胞內運動”。

　　LPL提高了腸粘膜細胞的活動，5種上調的DEPs與粘蛋白分泌有關:2種角蛋白(KRT13和KRT15),2種黏蛋白(MUC2和MUC5)和1種酶(GALNT12)。

　　LPL組動物腸道中，一組廣泛上調的DEPs與“細胞代謝”過程相關(圖4B)，如“復合糖類水解”、“糖酵解”、“脂代謝”和“蛋白酶體活性”。

　　其他上調的DEPs處于蛋白質合成的相關通路中，包括“mRNA成熟”、“蛋白質翻譯”、“蛋白質定位”以及“新形成蛋白的翻譯后修飾(PTMs)”。

　　圖3 LPL組鮭魚腸道中上調A)DEPs相互作用功能富集圖

　　LPL顯示出下調腸道應激反應

　　腸道119種下調DEPs中19種DEPs聚類為“應激反應”,7種DEPs為“病毒處理”,4種DEPs為“I型干擾素信號通路”，有些蛋白質歸屬其中的2種聚類，1種歸屬于所有聚類。

　　LPL對肝臟脂質代謝、氨基酸代謝和碳水化合物代謝的上調作用

　　LPL組魚體肝臟中174種DEPs相互作用網絡110種DEPs聚類"代謝過程"（圖5），56種顯著聚類代謝反應通路，18種聚類“脂質代謝”,21種聚類“固有免疫系統”。與腸道中觀察到的相似，一些DEPs受翻譯后修飾的影響:103種DEPs可被磷酸化，72種DEPs可被乙酰化，表明飼料LPLs可能參與這些通路。

　　肝臟中上調的DEPs中，69種聚類為“代謝過程”，42種聚類“轉運過程”。LPLs引起肝臟上調的代謝通路靶點為“脂質代謝”(14種DEPs)、“氨基酸代謝”(9種DEPs)、“碳水化合物代謝”(6種DEPs)以及“三羧酸循環”。

　　肝臟中74種下調的DEPs功能富集分析顯示，LPLs主要影響與“應激反應”(49種DEPs)相關,這與腸道下調應激反應一致。

　　圖5 LPL組鮭魚的肝臟蛋白質組相互作用功能富集圖

　　LPL明顯改善了腸道和肝臟功能，營養素代謝增強，應激反應下調

　　根據對腸道和肝臟中蛋白相互作用，及各功能富集的數據分析，得出飼料LPLs的作用模式（圖6）。飼料中添加0.1%基于LPL的添加劑3個月后，鮭魚腸道和肝臟功能均發生了改變。

　　最相關的生物學過程、生物分子通路和翻譯后修飾(PTMs)顯示，飼料LPLs顯著促進腸細胞功能改善，囊泡運輸、復合糖類水解和脂質代謝以及推測的黏液生成得到改善。飼料LPLs刺激肝臟活動，增強脂質、碳水化合物和氨基酸的代謝，并提高Krebs循環獲得能量。腸道和肝臟均下調了應激反應活性，可能緩解炎癥狀況。大量上調和下調的差異表達蛋白是翻譯后修飾(PTMs)（特別是磷酸化和/或乙酰化作用）的靶點。

　　圖6飼料LPLs在鮭魚腸道和肝臟中的作用模式綜述

　　LPLs對腸道細胞組分和細胞轉運的調節作用以及對腸道屏障完整性促進作用。

　　蛋白質組學技術可以鑒定出魚類不同發育階段、不同攝食情況、應激或疾病條件下的蛋白質表達差異，全面概述魚類代謝中的部分功能。本研究采用鳥槍法蛋白質組學鑒定出了大量蛋白質(腸道和肝臟分別為4850和4984種)。

　　功能富集分析顯示，飼料中LPLs主要通過兩種方式影響腸道細胞功能:

　　1-細胞組分(70種DEPs)，包括細胞組成裝配、排列或拆卸過程；

　　2-細胞轉運(57種DEPs)，即細胞組分（例如胞內復合體和細胞器）進出細胞、胞內移動以及細胞間的定向移動。

　　“囊泡運輸蛋白網絡”的富集(12種DEPs)表明，LPLs有利于大分子的攝入和轉運，與哺乳動物中的研究報告一致，即LPLs可以修飾膜的脂質雙層，改變膜流動性和營養物質的跨膜通透性，從而促進營養物質的消化率(Lundbæk et al.,2010;Huo et al.,2019)。新發現顯示，改善囊泡運輸可能是更好的黏液分泌和維持腸道屏障完整性的基礎(例如某些黏蛋白、斑周蛋白和角蛋白的上調)。

　　LPLs顯著上調了肝臟脂質代謝，促進了肝臟脂質轉運至脂肪組織

　　魚體肝臟對營養狀況高度敏感。飼料LPLs在肝臟中的作用之一是防止脂肪異常積累(Leeson和Summers,2001)。在虹鱒(Adhami et al.,2021)和斑點叉尾鮰(Liu et al.,2019)中均有顯示添加溶血卵磷脂后肝臟中的脂質含量降低、腸道脂肪酶活性增加。推測LPL促進了肝臟合成的脂蛋白的運輸，從而將其從肝臟轉運至脂肪組織。該實驗發現LPL引起大西洋鮭肝臟脂質代謝上調(20種DEPs，包括14種DEPs富集在“脂質代謝”反應通路)，首次證明了飼料LPLs改善肝臟脂質代謝的內在機理。

　　一些被飼料LPLs上調的蛋白質是相關代謝酶，如：

　　長鏈脂肪酸——輔酶A連接酶1，可激活長鏈脂肪酸β-氧化降解和細胞脂質合成。

　　細胞色素P4501A1，參與多種化合物包括類固醇、脂肪酸和異生物素的氧化。

　　脂肪酰胺水解酶2，可降解具有生物活性的脂肪酰胺。

　　酰基輔酶A去飽和酶，在參與調節線粒體脂肪酸氧化的基因表達中發揮重要作用。

　　ATP結合盒轉運蛋白D亞基3抗體，該蛋白可能參與支鏈脂肪酸和C27膽汁酸轉運到過氧化物酶體，后者是膽汁酸生物合成的關鍵。

　　脂肪酸結合蛋白，該蛋白在長鏈脂肪酸及其酰基輔酶A酯的胞內轉運中發揮作用，可能參與富含甘油三酯的脂蛋白的合成，有利于肝臟釋放脂質。

　　改善肝臟脂質代謝方面，飼料中LPL似乎增強了整個肝細胞的功能。

　　上調的DEPs包括以下反應通路:“氨基酸代謝”(9種DEPs顯著聚類)，“碳水化合物代謝”(6種DEPs)以及“檸檬酸循環和呼吸鏈電子傳遞”(5種DEPs)。有研究報道指出，LPLs通過激活細胞表面G蛋白偶聯受體(GPCRs)發揮激素樣細胞介質的作用，并通過過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPAR-γ)發揮細胞內第二信使的作用(Tsukahara et al.,2017;Wepy et al.,2018;Shanbhag et al.,2020)。飼料LPLs上調的作用模式的意外發現鼓勵我們在魚類和陸生物種中進一步研究。

　　LPLs對腸道和肝臟的應激反應下調，可能與促炎狀況降低有關

　　LPL組魚體腸道和肝臟中下調的DEPs主要聚類為與組織反應性相關的生物過程，如腸道中“應激反應”(19種DEPs)和“細胞組分”(119種下調的DEPs中54種聚類)，以及肝臟中的“應激反應”(74種下調的DEPs中49種)。研究表明，添加與LPLs功能相似的膽汁酸可以提高抗氧化酶活性，減輕高脂肪水平對家畜抗氧化系統的損害(Zhang et al.,2022)。最近在大口黑鱸中進行的一項研究表明，添加LPLs增加了腸道菌群中有益微生物群的豐度，并降低了有害微生物群的豐度，這同樣可能與補充LPL的魚類應激反應較低有關。我們推測LPL組魚體應激反應的降低可能與促炎狀況降低相關。

　　LPLs除了其乳化作用外，還具有調節蛋白質功能的作用

　　該研究顯示由LPLs引起的蛋白質相互作用的變化，大部分檢測到的DEPs都是翻譯后修飾(PTM)（主要是乙酰化和磷酸化）的假定靶點。PTMs是通過調節蛋白質結構、活性、定位或蛋白質-蛋白質相互作用來動態調節細胞代謝狀態的可逆過程。PTMs可以激活或失活蛋白質的催化功能，或影響蛋白質的生物活性(Ramazi和Zahiri,2021)。基于本研究結果推測：LPLs除了其乳化作用外，還具有調節蛋白質功能的作用。雖然目前沒有關于LPLs和PTMs之間直接關系的具體數據，但一些證據表明LPLs在細胞信號傳導中有明確的作用。LPL對細胞的多種影響包括有絲分裂發生、分化、細胞遷移以及細胞生存能力(抗凋亡)等(Torkhovskaya et al.,2006)。其作用由特異性G蛋白偶聯受體（GPCRs，G-protein-coupled receptors）通過涉及細胞內蛋白激酶鏈的蛋白偶聯信號轉導到細胞核介導。脂質第二信使可以調節細胞促炎因子的表達。本研究首次證明了飼料LPL對海水魚類蛋白質相互作用組學的直接影響，為研究LPL在動物營養中的益處開辟了一個新的窗口，并可推廣到其他經濟品種，如魚類、家禽、哺乳動物(豬和牲畜)，甚至人類。